目前，低温冷冻保存是生物材料长期保存的唯一可行途径，然而最先进的冷冻保存技术对稍显复杂的细胞尚难以实现较高复活率，更无法成功实现组织器官和复杂生命个体的低温保存。在临床医学的应用上，组织和器官长期冷冻保存技术的缺失为再生医学的发展带来巨大的限制。临床上目前多采用短期低温保存或延时保存技术（4 °C左右）用于器官移植，但器官的冷缺血耐受时间较短，典型的譬如：心肺4小时，肝、肠、胰腺8~12小时，肾最长，为36小时，但其功能细胞肾小球耐受时间只有不到24小时。由此导致目前临床超过70%的心脏因为评估和匹配的所需的时间超过了保存限制而被废弃。针对这样的现状，寻求器官长期有效的冷冻保存方法是最有效的解决方案，但这一直都是冷冻保存技术的“阿喀琉斯之踵”。为了寻找理想的低温保存方法，中国科学院理化技术研究所低温工程学重点实验室低温生物与医学课题组从自然界的耐寒生物中寻找灵感，学习耐寒生物的耐寒机制及应对低温损伤的策略，调节生物应对低温及冷冻伤害时的代谢活动，探究器官冷冻保存的可行之路。
自然界中有许多耐寒生物（例如某些昆虫和两栖类动物）能够通过合成及积累冷冻保护剂、保护性脱水等措施来抵抗冬季寒冷的刺激。受这些抗冻机制的启发，在饶伟研究员的主导下，研究小组通过低温驯化及喂饲低温保护剂L-脯氨酸，成功将冷冻敏感型日本弓背蚁（Camponotus japonicus Mayr）转化为冷冻耐受型（图1）。该研究成果发表在Science Bulletin。其中，中国科学院理化技术研究所研究生窦蒙家及联合培养生李亚洲为本文共同第一作者，李雷副研究员和饶伟研究员为文章的共同通讯作者。
图1. L-脯氨酸训饲使冷冻敏感型蚂蚁转化为冷冻耐受型生物体。图片来源：低温生物与医学课题组
文章首先详细探讨了冷冻时间、降温速率、冷却最低温度、复温温度等因素对蚂蚁存活率的影响，并提出了最优化的冻存方案。在此基础上，对 L-脯氨酸喂饲及低温驯化后的蚂蚁进行冷冻-复温实验。使蚂蚁在−27.66 °C下的冻存活率从37.50%（自然状态下的冻存活率）提高到了83.89%（图2），而且冻存复温后的蚂蚁依旧能保持正常的形态，并拥有肢体活动及进食的能力。
图2. 日本弓背蚁耐寒性提升。(a)蚂蚁体液凝固点随L-脯氨酸的积累而降低；(b)不同浓度L-脯氨酸训饲的蚂蚁经历-27.66 °C低温后的存活率；(c)自然界采集的蚂蚁的形态；(d)蚂蚁冷冻后的形态。图片来源：低温生物与医学课题组
同时，利用低温显微镜控温及红外影像分析，可视化地展现了降温及升温过程中蚂蚁体内温度的变化及分布（图3）。研究结果表明，L-脯氨酸在蚂蚁体内的积累使得蚂蚁在降温过程具备较低的降温速率，而在升温过程升温速率较快（图3）。最为重要的是，L-脯氨酸的积累有助于减轻蚂蚁脑部的结冰过程，大大保护了中枢神经系统在低温下的损伤，对提升蚂蚁的抗冻能力至关重要。
图3. 蚂蚁在降温和复温过程中体温的变化及不同部位的温度分布。(a) 2 °C min-1降温速率下的蚂蚁红外热成像；(b) 2 °C min-1升温速率下的蚂蚁红外热成像；(c)喂食Pro-0和Pro-30日粮的蚂蚁在降温和升温过程中的平均体温；(d)喂饲Pro-0的蚂蚁体内不同部位的平均温度；(e) 喂饲Pro-30的蚂蚁体内不同部位的平均温度。图片来源：低温生物与医学课题组
为了进一步明确L-脯氨酸驯饲对蚂蚁存活的生理学机制，研究人员对蚂蚁体内的氨基酸含量进行了代谢组学分析，并且运用热力学方法对于含水量进行了定量检测（图4）。结果表明，喂饲富含L-脯氨酸的饲料使蚂蚁体内的L-脯氨酸含量从1.78 ng g−1积累到 4.64 ng g−1，并且其他氨基酸（例如丙氨酸、谷氨酸、天冬酰胺等）的含量也有所增加。差式扫描量热仪（DSC）等分析证明，驯饲后的蚂蚁体内水含量，特别是自由水的比例降低，这有助于蚂蚁体液冰点的减低，减少低温损伤。这些发现表明，研究小组提出的人工驯饲策略，与自然界中生物通过积累抗冻物质（例如海藻糖、抗冻蛋白等）及脱水等来应对冬季寒冷挑战的耐寒机制一致。
图4. L-脯氨酸训饲后的蚂蚁的生物物理学变化。(a)对不同浓度L-脯氨酸训饲后蚂蚁氨基酸代谢分析；(b)不同浓度L-脯氨酸训饲对蚂蚁体内L-脯氨酸浓度的影响；(c) Pro-0和Pro-30训饲的蚂蚁不同身体部位(头部、胸部和腹部)内L-脯氨酸的积累；(d)蚂蚁体内渗透活性水和非渗透活性水的比例。图片来源：低温生物与医学课题组
此外，基因分析显示热激蛋白等基因表达提高，进一步阐释了蚂蚁应对寒冷刺激的生物学作用机制（图5）；同时检测发现大部分上调的基因位于核糖体中，而核糖体正是L-脯氨酸代谢的主要细胞器。
图5. L-脯氨酸驯饲后蚂蚁的基因表达变化。（a）差异表达基因火山图；(b) L-脯氨酸驯饲后的代表性上调基因的热图谱；(c) 训饲蚂蚁前后的差异基因基于日本京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析；(d) 训饲蚂蚁前后的差异基因基于基因本体(Gene Ontology, GO)数据库富集分析的生物过程有向无环图。图片来源：低温生物与医学课题组
这项研究通过热力学条件优化筛选与L-脯氨酸驯饲成功地提升了非耐寒性日本弓背蚁的耐寒能力（图6），L-脯氨酸驯饲后的蚂蚁在-27.66 °C冷冻的存活率相比较对照组增加了两倍多。热力学及代谢组学分析揭示出L-脯氨酸在蚂蚁体内的积累，蚂蚁体内活化水含量降低等因素均有助于减少冷冻损伤。更为重要的是，本研究首次阐明了外源性冷冻保护剂在蚂蚁体内的积累对于蚂蚁的基因调控与耐寒性提升之间关系的影响。冷敏感蚂蚁相变过程中抗损伤机制的研究将为今后组织器官保存和复杂生物体的低温保存相关研究提供理论和技术支持。
图6. L-脯氨酸训饲后蚂蚁的抗冻能力提升机制。图片来源：低温生物与医学课题组
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L-proline feeding for augmented freeze tolerance of Camponotus japonicus Mayr
Mengjia Dou, Yazhou Li, Ziqiao Sun, Lei Li, Wei Rao
Sci. Bull., 2019, DOI: 10.1016/j.scib.2019.09.028
导师介绍
李雷
中国科学院物理化学技术研究所副研究员。2003年获清华大学热能工程系学士学位，2009年获清华大学医学院生物医学工程系博士学位。2015年至2016年哈佛大学医学院麻省总医院访问学者。主要从事微流控芯片相关研究，近期关注于微组织工程技术、生物保存和微流体平台的交叉研究工作。
饶伟
中国科学院物理化学技术研究所研究员。2003年与2006年分别获得哈尔滨工业大学学士及硕士学位，2009年获中国科学院物理化学技术研究所低温与制冷工程博士学位。2010年至2015年分别在弗吉尼亚联邦大学及俄亥俄州立大学进行research scientist 及博士后研究。长期致力于低温生物学、微/纳米材料和常温液态金属等交叉学科，希望将前沿的微/纳米技术引入冷冻医学，以实现冷冻过程能质的精确调控。
http://www.ipc.cas.cn/sourcedb_ipc_cas/cn/lhsrck/dwswyyxyjz/201607/t20160714_5262415.html
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