石墨烯(Graphene)是一种二维碳纳米材料，其优异的光学、电学、力学特性，在材料学、微纳加工、生物医学等方面具有重要的应用前景，其发现者获得2010年诺贝尔物理学奖。

近年来，被认为是石墨烯的替代物的黑磷(BP)，作为一种新兴的二维材料，因其优越的机电性能、热电性和拓扑特性，在生物医学领域，如药物传递，组织修复和导电材料领域得到了越来越多的关注。尽管黑磷在众多领域都崭露头角，但它在动物体内的生物安全性仍然存在争议。

上海交通大学Fan Cunyi 教授研究团队，近日报道了一种由黑磷和聚己内酯(PCL)组装而成的纳米材料。研究证明，在神经再生的过程中，黑磷复合支架的毒性可以忽略不计，并且在轻度氧化应激条件下，可诱导血管再生和神经再生，并刺激钙依赖性轴突再生和髓鞘形成。该研究成果以题为“Concentrically Integrative Bioassembly of a Three-Dimensional Black Phosphorus Nanoscaffold for Restoring Neurogenesis, Angiogenesis, and Immune Homeostasis”的论文发表在《纳米快报》上（见文后原文链接）。

【一、黑磷复合支架的设计】

研究者首先利用二氯甲烷溶液溶解BP和PCL，超声20分钟后制成纳米悬浮液。研究者将不同比例的BP/PCL溶液通过多个喷嘴喷在旋转的棒状接收器上，并在固化的BP/PCL层上滚动一个微针弧形面板，以创建均匀间隔的排列气孔。BP/PCL纳米支架表面呈现出相对粗糙的分层结构，且层与层之间交错排列(Fig1. b,c)。纳米支架表面布满直径为20μm的小孔。作者认为支架层层交错可以诱导细胞的附着，并且防止外来细胞(如成纤维细胞)进入导管引起轴突定向障碍。支架表面的小孔允许水和氧的自由交换，满足正常轴突发芽的需要。

图1：基于BP的复合支架的制备与表征。(a) 黑磷(BP)/聚己内酯(PCL)纳米材料的制备示意图。将BP/PCL悬浮液从多个喷嘴喷射到旋转模具上，形成支架。当顺时针旋转30度时，翻转的微针电弧面板扣在固化的BP/PCL层上，形成均匀的孔隙排列。植入体内后，支架在体内募集血管生成因子并分散炎症信号。(b, c) BP / PCL支架的表面形貌。 (d, e) TEM显示BP在支架中的存在和分布。

【二、黑磷复合支架的安全性】

为了探究黑磷复合支架的安全性，研究者将支架植入大鼠体内后采集了心脏、肝脏、脾脏、肺、肾和大脑，并通过苏木精和伊红(HE)染色评估组织学变化。比较1% BP/PCL组、0.5% BP/PCL组、0.25% BP/PCL组、PCL组和自体移植物组体内移植后的器官形态，以及毒性阴性对照组(未手术或注射)和毒性阳性对照组(注射四氯化碳)。在阳性对照组中，各器官发生了显著的形态学改变。相反，在BP/PCL支架组、PCL支架组和自体移植物组中，与阴性对照组相比未见组织学异常。这说明PCL、0.25% BP/PCL、0.5% BP/PCL、1% BP/PCL支架组对主要器官的毒性不显著(Fig.2)。

图2：基于BP的复合支架的体内生物安全性评价。不同的BP/PCL支架和自体移植物植入后主要功能器官(心脏，肝脏，脾脏，肺，肾和大脑)的HE染色。

【三、黑磷复合支架参与免疫调节】

为了评估黑磷复合支架的治疗效果，研究者检测了它们在损伤神经中的抗炎和抗氧化潜力。植入4个月后，将再生的坐骨神经与未完全降解的导管分离。研究者评估了氧化应激和炎症的标记物，血红素oxygenase-1 (HO-1)和肿瘤坏死因子α(TNF-α) (HO-1在活性氧(ROS)产生时调节细胞行为，以维持氧化还原的稳态，TNF-α被用来评估组织的炎症状态) 。结果显示，TNF-α在PCL和1% BP/PCL支架组的表达高于在0.25% BP/PCL、0.5% BP/PCL支架和自体移植物组中的表达。同时，HO-1的表达在0.25% BP/PCL和0.5% BP/PCL支架及自体移植物组中均显著升高。

图3：基于BP的复合支架在体内的免疫调节。 (a)术后4个月1% BP/PCL、0.5% BP/PCL、0.25% BP/PCL、PCL和自体移植物组的HO-1免疫荧光染色。(b)术后4个月1% BP/PCL、0.5% BP/PCL、0.25% BP/PCL、PCL和自体移植物组的TNF-α免疫荧光染色。(c) HO-1和TNF-α相对表达水平。

图4：基于BP的复合支架在体内促进血管生成。 (a,b) 术后4个月1% BP/PCL、0.5% BP/PCL、0.25% BP/PCL、PCL和自体移植物组的CD34和VEGF免疫荧光染色。 (c) CD34和VEGF相对表达水平、微血管密度(MVD)、血管样结构(VLS)区域。

【四、黑磷复合支架促进神经再生】

研究者探究了黑磷复合支架对髓纤维和轴突的再生促进作用。通过HE染色、甲苯二甲苯胺蓝(TB)染色和透射电镜(TEM)等形态分析，研究者发现负载BP的PCL支架促进了轴突伸长和髓鞘增厚(Fig.5)。

图5：基于BP的复合支架再生的坐骨神经在体内的形态、功能和电生理性能。(a) 不同BP基支架和自体移植物组再生的坐骨神经的HE和TB染色。(b) TEM图像显示各的组织再生髓鞘和轴突。(c)有髓鞘的轴突的数量，有髓鞘的轴突平均直径、再生轴突面积、髓鞘厚度、神经传导速度、远端复合运动动作电位、坐骨神经功能指数和退出延迟。

研究者通过免疫荧光技术对神经再生的相关标记物如NF200、Tuj1、GFAP、c-fos和BDNF进行了鉴定，发现黑磷的引入确实有助于神经再生。作者推测，黑磷复合支架所表现出的出色的神经再生能力是由于黑磷复合支架优越的导电性。作者进一步解释，神经组织具有电活性，可以将上游的电脉冲传导到神经分支和效应体。在本研究中，复合支架植入后，对损伤的周围神经产生抗炎、抗氧化和促血管的生成作用。再生过程开始后，生物电逐渐恢复，这种生物电通过复合支架的传导，改善了局部神经突起的延伸、再髓化和微血管的形成。

图6：生物体内纳米支架的神经标记物评价及AR染色研究。(a) NF200和Tuj1免疫荧光染色观察不同BP基支架和自体移植物组再生的坐骨神经。(b)各组大脑GFAP染色。 不同组的坐骨神经茜素红(AR)染色显示钙离子表达和NF200、Tuj1和GFAP的相对表达水平。

图7：生物体内钙信号通路的研究。(a,b) c-fos和BDNF染色检测不同BP基支架和自体移植物组的坐骨神经再生。(c) Ca2+、c-fos和BDNF相对表达水平。

全文链接：https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.9b03980