酶催化和相关固定化技术是实现绿色生物制造和可持续发展的重要研究领域。这个非均相化过程能大大提高酶的稳定性和回用等性能，在生物合成的连续生产、节能、环保等方面都具有重要意义。但是传统的固定化技术存在一系列挑战：1) 如果酶被固定在大尺寸（有孔或无孔）基质上，常导致无序或表面负载，无法很好的保护酶分子，易导致泄露和影响催化效能；而将酶限制在小尺寸狭窄孔道中，又可能对其形成物理挤压或影响酶作为柔性分子的自由度而影响其效能；2) 载体介入导致的传质阻力是固定化的另一大挑战，紧密固定在载体内部的酶难以与底物互作而使得整体催化活性降低，这对于一些多酶协同反应尤为不利。因此开发新载体材料和固定化技术以克服上述挑战，具有重要的理论与实践意义。
南开大学陈瑶研究员（点击查看介绍）课题组另辟蹊径，提出了一种固定化酶新策略，在保护和固定酶分子的同时，为其“松绑”，提供催化和传质所需的自由度和空间。整个过程分三步进行(图1)：首先，通过一锅法用MOFs对酶进行固定。然后MOFs材料作为模板促进COFs外壳的形成，又能在这个过程中对酶提供保护作用。最后，在温和的条件下对MOFs材料进行降解，同时对酶进行“松绑”，将其释放到所形成的COF胶囊中。胶囊在保护酶的同时，具有显著大于酶尺寸的额外空间，因而可以提供给酶一定的自由度，利于其构象的保持和催化活性的发挥和促进传质，从而大大提高固定化酶的活性。这种新型的高性能生物反应器为多亚基的复杂生物大分子（如酶）以及多酶级联反应的应用提供新的平台。
图1. 三步法制备生物分子@COF胶囊结构的示意图。
上述制备方法具有良好的普适性，作者使用三种MOFs–ZPF-2、ZIF-8和ZIF-90，两种COFs–COF-42-B和COF-43-B均能得到COF胶囊结构。作者选用具有多亚基结构的过氧化氢酶(CAT)为代表，探究了酶分子在这种胶囊结构中的催化行为。结果表明，通过酸降解去除MOF内核，将酶释放到COF胶囊，形成的CAT@COF-42酶反应器活性大大提高，其Kobs值比CAT@ZPF-2提高约58%(图2a)，而相对于CAT@ZPF-2@COF-42-B（未去除MOF内核前），这一增量可达210%。作者进一步改变单体长度，制备了CAT@COF-43-B胶囊结构。得到的CAT@COF-43-B (Kobs=0.0843 s-1) 的活性比CAT@ZPF-2 (Kobs=0.0471 s-1)提高81%，优于COF-42-B胶囊酶反应器(图2b)。这种差异主要归因于COF-43-B的孔径 (3.2 nm) 大于COF-42-B (1.9 nm)，更有利于底物和产物的传质，利于生物催化反应的进程。作者对COF胶囊厚度和尺寸等因素也进行了优化和调控。另外，在胶囊的保护下，CAT@COF-42-B对热、蛋白酶、有机溶剂、以及酸等外界环境的耐受性都有显著提高 (图2c)，并展现出优良的循环利用性，反复催化10次后，其催化活性无明显降低 (图2d)。实验表明,这种新型策略同样适用于其他酶以及多酶级联体系。展现了COFs胶囊作为高性能生物反应器的巨大潜力。
图2. CAT@COF胶囊的活性表征。a) CAT@ZPF-2, CAT@ZPF-2@COF-42 以及 CAT@COF-42-B 催化降解H2O2的动力学过程表征。b) CAT@ZPF-2, CAT@ZPF-2@COF-43 以及CAT@COF-43-B 催化降解H2O2的动力学过程表征。c) CAT@ZPF-2, CAT@ZPF-2@COF-42以及 CAT@COF-42-B在不同环境下活性的稳定性探究。d) CAT@COF-42-B循环催化性能表征。
总结
南开大学药学院陈瑶研究员课题组以金属-有机框架材料(MOFs) 为模板，制备了高效负载酶等生物大分子的共价有机框架 (COFs) 胶囊，构建了操作简便、普适性强、可定制化的新型固定化酶平台。所制备的核壳胶囊生物反应器可有效提升酶对抗外界环境的稳定性，并赋予酶更高的自由度和空间，在提升催化活性的同时促进传质，对于多亚基的复杂酶分子及多酶级联反应，展现出优异的性能。这个新策略适用于多种MOFs和COFs,且突破了酶的尺寸限制。该工作为理解酶分子的催化行为，以及新型生物反应器、先进微装置和人工亚细胞器的构建提供了新的思路。
这一成果近期发表在Journal of the American Chemical Society 上，通讯作者是南开大学陈瑶研究员，第一作者是南开大学药学院博士研究生李明敏。该工作得到国家重点研发计划项目、国家自然科学基金和天津市自然科学基金的支持。
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Fabricating Covalent Organic Framework Capsules with Commodious Microenvironment for Enzymes
Mingmin Li, Shan Qiao, Yunlong Zheng, Yassin H. Andaloussi, Xia Li, Zhenjie Zhang, Ang Li, Peng Cheng, Shengqian Ma, Yao Chen*
J. Am. Chem. Soc., 2020, 142, 6675-6681, DOI: 10.1021/jacs.0c00285
陈瑶研究员简介
陈瑶研究员围绕“高性能生物分子固定化平台的构建‘’展开研究，已在相关领域发表论文52篇，其中以第一或通讯作者发表29篇（成立独立课题组近三年以通讯作者发表论文19篇，篇均影响因子>11），他引1800余次，两篇论文入选ESI高被引。论文发表在J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Adv. Mater.、Chem. Soc. Rev.等国际知名期刊。撰写英文专著章节，申请中国专利1６项和PCT2项，并获授权美国专利一项。任中国生物化工学会青委会委员、生物医学工程学会（纳米分会）青年委员。获得2014年国家优秀自费留学生奖，并入选2016年天津市青年千人计划。
课题组链接
https://www.x-mol.com/groups/chen-yao
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